Stéphane Freiss entame des études d'histoire à l'université Paris 10-Nanterre, qu'il abandonne pour suivre une formation d'acteur au cours Yves Pignot. Il obtient en 1985 son diplôme du Conservatoire national supérieur d'art dramatique puis devient pensionnaire de la Comédie-Française. Après un premier film aux côtés d'Emmanuelle Béart, Premiers désirs, il tourne sous la direction d'Agnès Varda et de Pierre Jolivet. Il se fait remarquer en 1987 dans Chouans ! de Philippe de Broca, qui remporte un grand succès et pour lequel il obtient le César du meilleur espoir masculin en 1989. Il décroche le second rôle de La Putain du roi avec Timothy Dalton en 1990 puis enchaîne les comédies et les drames. Dans les années 2000, il alterne des rôles au cinéma, au théâtre - remportant plusieurs prix à la Nuit des Molières - et dans des téléfilms. Il a aussi prêté sa voix à la lecture de quelques textes de littérature, notamment les oeuvres poétiques d'Andrée Chedid.