Fille du peintre Alfred Roloff, Margarethe Von-Trotta est élevée par sa mère, aristocrate balte, à Düsseldorf. Après avoir réussi l'équivalent du brevet des collèges, elle fait deux ans d'études commerciales dans un lycée technique et travaille ensuite dans un bureau. Elle découvre le cinéma (Ingmar Bergman, la Nouvelle Vague) lors d'un séjour à Paris.
Elle passe son baccalauréat au début des années 1960 et se lance dans des études d'arts plastiques à Düsseldorf. Puis elle s'installe à Munich où elle étudie la philologie des langues germaniques et romanes. Mais une fois de plus elle change de voie pour entrer dans un conservatoire d'art dramatique. C'est en 1964 qu'elle obtient son premier grand rôle à Dinkelsbühl.
En 1964, elle épouse le scénariste Felice Laudadio avec lequel elle aura un fils, Félix. Ils se séparent en 1970. Après s'être produite à Stuttgart, elle trouve du travail au Kleines Theater (Petit Théâtre) de Francfort où elle sera actrice de 1969 à 1970. Von Trotta devient une actrice demandée dans le milieu des jeunes réalisateurs allemands, Herbert Achternbusch, Rainhard Hauff, et Rainer Werner Fassbinder. Elle fera quatre apparitions dans les films de ce dernier.
En 1971, elle épouse en secondes noces le metteur en scène Volker Schlöndorff dont elle divorcera en 1991. Depuis 1977, elle est passée à la réalisation. Après son divorce, elle s'installe en Italie, puis à Paris où elle réside aujourd'hui.
Elle est élue membre de l'Académie des arts de Berlin en 1984.